DMP法測定漆酶酶活

 DMP法測定漆酶酶活

A.1 原理

漆酶能氧化DMP為3，5，3’，5’-四甲氧基二苯基醌，該產物在470nm處有最大吸收峰，其消光系數為49.6 mmol^-1Lcm^-1，在一定濃度范圍內該產物濃度與其吸光度值成線性關系，通過測定吸光度的變化值來計算產物的生成速率，酶活的定義為在一定條件下，每分鐘氧化1 umol DMP或生成1umol 3，5，3’，5’-四甲氧基二苯基醌所需要的酶量定義為1個酶活單位。

A.2.1 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 3.5）

稱取檸檬酸14.71g，用水準確稀釋至700ml，稱取磷酸氫二鈉14.33g，用水溶解并準確稀釋至200 mL。將檸檬酸溶液加入到磷酸氫二鈉溶液中，邊加邊攪拌并調pH至3.5。

A.2 .2 DMP

    稱取DMP0.154g，用水溶解并定容至100mL。

A.3 儀器和設備

可見分光光度計

分析天平：精度為±0.0001g。

pH計：精度為±0.01 pH單位。

恒溫水?。壕?plusmn;0.2℃

A.4 步驟

漆酶酶活測定以DMP為底物，每3ml反應體系含：2.4ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 3.5），0.5ml DMP，60 ℃保溫5 min，加入0.1ml（稀釋適當倍數的）酶液，同時按下秒表計時，在470 nm處用可見分光光度計在0s時記錄一次吸光度值，記為X₀，間隔60s再記錄一次吸光值，記為X₆₀。

固體酶制劑測酶活預處理：稱取0.1g固體粉末，加1ml去離子水溶解，待充分溶解后8000rpm離心5min，取上清按上述方法測其酶活。測得酶活單位為U/ml，換算成固體酶制劑的酶活還需乘以系數10，酶活單位為U/g。

A.5 計算結果

E= ×n×7.258     …………………………………（A.1）

式中：

E：酶活力，U/ml

X₆₀：60s時記錄的吸光度值

X₀:0s時記錄的吸光度值

n：稀釋倍數

A.6 精密度

    在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對值不應超過平均值的3%。

此方法僅作為參考，具體環境不同，相應的也會有所不同！