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        超氧化物歧化酶的活性測定

        超氧化物歧化酶(SOD)的活性測定 黃嘌呤氧化酶法

        原 理:通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生 超氧陰離子自由基(O2-),后者氧化羥胺形成亞 硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈紫紅色,用可見光 分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含SOD時, 則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用,使 形成的亞硝酸鹽減少,比色時測定管的吸光度值 低于對照管的吸光度值,通過公式計算可求出被 測樣品中的SOD活力。 實驗試劑: 硫酸鹽緩沖液,鹽酸羥胺,黃嘌呤,黃嘌 呤氧化酶,醋酸等。

        實 驗步驟: 計算方法: 每毫升反應液中SOD 抑止率達50%時對應 的SOD 量為一個SOD 活力單位(U),待測 樣品中的SOD 活力由下式計算: SOD抑制率(%)=(A2-A1)/A2×100% SOD 活力(U/ml)=(A2-A1) /A2×100%÷50%×反應體系的稀釋倍數× 樣本測試前的稀釋倍數 式中:A1:測定管的吸光值;A2:空白管的 吸光值。

        鄰苯三酚 自氧化法  原理: 在堿性條件下, 鄰苯三酚迅速氧 化釋放出超氧化物陰離子,生成有色中間 產物,吸光度隨之增加,使吸光度值與反 應時間呈良好的線性關系。 SOD 加入鄰苯 三酚自氧化反應體系后,催化超氧化物陰 離子生成過氧化氫,使有色中間產物的生 成受阻,導致吸光值下降,鄰苯三酚自氧 化速率降低,可作為測定 SOD 活性的理論 依據。

        1.試劑: 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液 (pH8.2 2mmol/L EDTA) 0.2mol/L (Tris)三羥甲基氨基甲烷(內含 4mmol/L 乙二胺四乙酸EDTA )100ml 與 0.2mol/L HCl44.76ml 混合加雙蒸水至 200ml pH8.2±0.01;鄰苯三酚(45mmol/L)以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液存放于冰 箱備用。

        2.儀器: 紫外分光光度計,酸度計,恒溫 水浴鍋

        實 驗步驟: (1).鄰苯三酚自氧化速率測定: 在試管中加入4.5ml 50mmol/LTris緩沖溶液,于 25℃保溫20min,加入10~20ul 30mmol/L鄰苯三 酚,立即計時并搖勻,傾于比色杯內,于325nm 下,每隔1min測吸光值一次,空白以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚,要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。 ? . SOD活性測定: 將樣液加入到Tris緩沖溶液中,其余步驟同自 氧化速率測定方法。 活力單位定義:將一定條 件下使每毫升反應液自氧化速率抑制50%的酶量 定義為一個單位(u)。

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